本標準規(guī)定了飼料中有效賴氨酸的測定方法。
本標準適用于含有動物或植物性蛋白質的配合（混合）飼料及單一飼料。
2引用標準
GB6432飼料粗蛋白測定方法
3術語
有效賴氨酸是指在規(guī)定的測定條件下測得的總賴氨酸和非有效賴氨酸之差。
4原理
蛋白質中有效賴氨酸的ε-氨基可與2，4-二硝基氟苯反應，酸解后生成二硝基苯賴氨酸，而其他非有效部分則生成賴氨酸。因此將不經(jīng)二硝基氟苯處理的樣品和經(jīng)由二硝基氟苯處理的樣品分別水解，用離子交換色譜法測定各自的賴氨酸含量，即可由其差值得出樣品中有效賴氨酸的含量。
5試劑和溶液
本標準所用試劑均為分析純，水為去離子水。
5.1乙醚（HG3-1002）。
5.2碳酸氫鈉（GB640）溶液：80g/L。
5.32.4-二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液：
將一定量的DNFB溶于95％乙醇，其體積比為0.15∶12，該溶液用前現(xiàn)配。
5.4鹽酸（GB622）溶液：6.0mol/L。
5.5鹽酸（GB622）溶液：6.5mol/L。
5.6稀釋用檸檬酸鈉緩沖液：pH約2.2。
將下列試劑依次溶于適量水：
20g水合檸檬酸（HG3-1108）
8g氫氧化鈉（GB629）
16mL濃鹽酸（GB622）
0.1mL辛酸
20mL硫二甘醇
加水稀釋至1000mL。
5.7層析用檸檬酸鈉緩沖液：
pH值及配制方法依不同型號的氨基酸測定儀有所區(qū)別，請參見儀器說明書配制。
5.8茚三酮試劑
按儀器說明書配制。
5.9賴氨酸標準液：50nmol/mL或其他濃度。
先配制2.5μmol/mL賴氨酸標準貯備液：稱取45.6mg賴氨酸單鹽酸鹽溶于0.1mol/L的鹽酸中，稀釋至100mL，混勻。
用該標準貯備液或商品2.5μmol/mL的標準氨基酸混合液，以pH2.2檸檬酸鈉緩沖液為溶劑配制50.0nmol/mL標準液。也可根據(jù)儀器說明書配制成其他最佳使用濃度。
6儀器、設備
6.1實驗室用樣品粉碎機：能快速一致地粉碎樣品并能避免樣品過熱和盡可能少與外界接觸。
6.2樣品篩：孔徑0.25mm（60目）。
6.3分析天平：感量0.0001g。
6.4油浴：溫度可穩(wěn)定于120～130℃之間。
6.5回流水解裝置：150mL、500mL短頸燒瓶以玻璃磨口接頭與回流冷凝器（長約35～40cm）相接。
6.6離心機：4000r/min。
6.7旋轉蒸發(fā)器。
6.8氨基酸自動分析儀。
6.9回流水解裝置：50mL水解管或消煮管，具磨口接頭與回流冷凝器相接。
6.10金屬塊消煮爐：要求溫度保持在120～130℃之間，必要時可加繼電器和接點溫度計控制。金屬塊內消煮管的受熱深度應高于或等于25mL消煮液的液面高度。
6.11水浴
7試樣制備
采集具代表性的配合（混合）飼料或單一飼料，按四分法縮分制備實驗室樣品，取10～20g粉碎，使其全部通過樣品篩（6.2）。充分混勻，裝入密閉容器。
8分析步驟
8.1A法
8.1.1總賴氨酸
8.1.1.1酸水解
稱取約含50mg粗蛋白質的樣品兩份，置于500mL燒瓶（6.5）中，加入250mL鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器，置120～130℃油�。�6.4）中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。
取下燒瓶，冷卻。必要時將酸解液（連同水解后不溶物）重新定容至250mL。過濾，吸取5mL濾液，于旋轉蒸發(fā)器（6.7）上，60℃左右蒸發(fā)至干。加水少許，重復蒸干1～2次。
將殘渣溶于5mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），離心10min（4000r/min），取上清液上機或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.1.2測定
打開氨基酸自動分析儀（6.8），使柱溫，反應浴溫度，緩沖液及茚三酮流速等各種操作參數(shù)達到預定要求，并按儀器說明書取一定量的賴氨酸標準液（5.9）進行校準。然后在同樣條件下取8.1.1.1中所得之樣品溶液進行測定。
8.1.2非有效賴氨酸
8.1.2.1二硝基苯化反應
稱取約含50mg粗蛋白的樣品兩份，置于150mL燒瓶（6.5）中，加入4mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min，其間需不時振搖。再加入6mLDNFB乙醇溶液（5.3），加蓋，振搖，注意勿使樣品顆粒粘附于瓶壁上。在室溫下暗處放置過夜。
8.1.2.2純化
在旋轉蒸發(fā)器上，溫度不高于40℃條件下，將上述反應物蒸干，加入35mL乙醚（5.1），振搖或攪拌后，待固體充分沉降，棄去絕大部分乙醚，小心不要帶出固體樣品顆粒。重復上述操作兩次，每次加25mL乙醚（此步驟乙醚層有時似較渾濁，只要傾倒時不帶出樣口顆粒，可不必離心）。最后，蒸發(fā)除去殘存乙醚。
8.1.2.3酸水解
邊沖洗瓶口瓶壁邊加入75mL鹽酸（5.4），使樣品全部浸于酸中，裝好回流冷凝器，置于120～130℃油浴中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。
取下燒瓶，冷卻。將水解物定量轉移至100mL容量瓶中，用水定容，過濾。吸取5mL濾液于旋轉蒸發(fā)器上，60℃左右蒸發(fā)至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
將殘渣溶于3mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），用離心機（6.6）離心10min，取上清液上機或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.2.4測定
同8.1.1.2。
非有效賴氨酸峰值較低，易受鄰峰或雜峰干擾，如某些氨基酸自動分析儀該峰分離不好，需將樹脂床（或分析柱）加長，或變換參數(shù)與程序。
8.2B法──簡化法
8.2.1總賴氨酸
準確稱取約含50mg粗蛋白質的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入25mL鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器并置于預先熱至120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，緩緩煮沸水解24h。
冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液2mL，于旋轉蒸發(fā)器，60℃濃縮至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
殘渣中加入適量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），（粗蛋白質含量為10％～20％的樣品加2mL，粗蛋白質含量為30％～50％的加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機。
8.2.2非有效賴氨酸
8.2.2.1二硝基苯化反應
稱取約含蛋白質20～25mg的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入2mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min（其間不時振搖），加入DNFB乙醇溶液（5.3）3mL，振搖混勻后，在室溫下暗處放置過夜。
將上述水解管置85～90℃水浴中蒸去乙醇，直至振搖時不產(chǎn)生泡沫為止。此時水解管內物應失重2.5～3g。
8.2.2.2純化
于去醇后的水解管內加入2mL乙醚（5.1），加塞，劇烈振搖后令其分層，棄去乙醚層，再用乙醚萃取兩次，每次10mL，棄去醚層后，將水解管放入60～70℃水浴，除去殘存乙醚。
8.2.2.3酸水解
邊沖洗管口管壁邊加入23mL鹽酸（5.5）裝好冷凝器，與測總賴氨酸樣品一道置120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，回流水解24h。
冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液5mL于60℃旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
殘渣中加入適量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6）（蛋白質含量10％～20％加3mL，30％～50％加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機。
9分析結果的表述
9.1總賴氨酸
樣品中總賴氨酸含量W1，以其質量百分率表示，即：
……（1）
式中：A──每毫升上機液中賴氨酸含量，ng；
m1──樣品質量，mg；
D──稀釋倍數(shù)。
9.2非有效賴氨酸
樣品中非有效賴氨酸含量W2，以其質量百分率表示，即：
……（2）
式中：A──每毫升上機液中賴氨酸含量，ng；
m2──非有效賴氨酸測定中樣品質量，mg；
D──稀釋倍數(shù)。
9.3有效賴氨酸
樣品中有效賴氨酸含量W3，以質量百分率表示，即：
有效賴氨酸W3＝W1-W2……（3）
若有效賴氨酸含量以其在總賴氨酸中的質量百分率表示，則
W3（％）＝〔（W1-W2）/W1〕×100……（4）
10重復性
同一試樣兩平行測定值的相對相差，應不超過其平均值的10％。
注：與生物測定法相比，本法測定結果偏高，在分析評價實驗結果時需加以注意。
